实验中必须坚持的一些好习惯 
总的注意事项： 
1. 加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均 
2. 移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性 3. 所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因  
一、防止RNA酶污染的措施 
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 

2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。 
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。 
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 

6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

二、常用的RNA酶抑制剂 
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 
4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 
因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容 
在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。研究人员造成的污染：RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理.

动植物总RNA提取-Trizol法 

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。 
在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。  
  1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10×106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞； 
  2、将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30℃下放置5分钟；然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。 在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟； 
  3、取上层水相（离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%）于一新的离心管，按每1mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温（15℃～30℃）放置10分钟，12000g（2℃～8℃）离心10分钟。【如果希望分离DNA或蛋白质，保留中层和下层酚-氯仿相，有机相能保存在4°C一夜】 
4、弃去上清液（RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁），按每1ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇进行洗涤，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟【RNA能够在–20°C保存在75%乙醇中至少1年，4°C保存至少1周】 
5、小心弃去上清液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会使RNA失去溶解性，导致A260/280 ratio <1.6。 
6、加适量Rnase-free water 溶解RNA沉淀，用枪头反复吸取混匀，55–60℃水浴10-15min。进行下游实验或-70℃保存备用。

7、RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

[注意]  
1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值 
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年.总mRNA的提取(自己的经验) 
一. 关于Trizol Reagent需要的试剂 
1． Chloroform：氯仿 (分析纯) 2． Isoproplyl alcohol：异丙醇(分析纯) 3． 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。 
4． RNase-free water：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%（V/V）加在dH2O中500ml（50ul），在37℃过夜，并高压灭菌即得（150℃ 3小时） 
5． 一次性塑料手套 
6． 注意：DEPC有致癌之嫌 
7.  抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul，取10ul加无Rnase水990ul，稀释100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：A260/280 ratio<1.6。 
8.  分离组织10mg（纯组织）加800ul Trizol试剂。  
二. DEPC处理方法如下： 
1. DEPC处理 
（1）DEPC水：100ml超纯水加入0.2ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。 （2） Tip头(枪头）、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip头；EP管和PCR反应管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37℃浸泡过夜，高压灭菌。 

2. 提取RNA，用DEPC水溶解 
3. RT 
我是用PCR仪来控制温度和时间的，所以RT是在PCR反应管中作的。 

4. 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。 
最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2ml的0.1%DEPC水，再灭菌就行了；现在有进口的RNASE FREE的枪头买，直接用不用处理的 。
 
三. 如何消除污染 
机器运行完后，取出PCR产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。 
（1） 试剂：mixer尽量分装，不要原瓶多次取用。 
（2） 加样：原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。 
另外，普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。 
目前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了UNG来防污染。Uracil-DNA N-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，来源于大肠杆菌重组克隆表达。  
四. RNA定量 
RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。 
RNA的贮藏，最主要的是温度，-20不够，最好-80，液氮最保险 
mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响  
五. RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行 
一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的  
电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量 。 
六. mRNA的分离与纯化中 
步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。  
七. 下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法： 保温试验 
方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。 
时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件）， 则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。  
八. PCR污染与对策 

1. PCR扩增产物污染 
这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，所以，扩增区的仪器什么如枪头等要注意。 还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
1). 标本处理区，包括扩增摸板的制备； 
2). PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增； 
3). 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。 
各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。 
切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。 
使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； 
操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度 2. 反应液污染 
可采用下列方法之一处理： 
1). DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列； 
2). 尿嘧啶糖苷酶（UNG）法 
由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。 
a、提取mRNA时所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然后烘干，高压灭菌，再烘干。 
b、用DEPC水洗过后当然不能用双蒸水洗了。那你用DEPC处理还有什么意义呢？还要用双蒸水洗吗？ 
c、玻璃器皿干烤：180度，8小时或更长时间；小器皿也可以用少许氯仿处理一下。另外，铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。

RNA提取 
一.RNA提取前的准备 
1. 研钵的处理 
1) 自来水反复冲洗； 
2) 去污剂或者洗涤灵冲洗； 3) 自来水反复冲洗； 4) 蒸馏水浸泡1~2d； 
5) 超净工作台内用无水乙醇冲洗2~3遍，晾干。（在RNA提取前，紫外杀菌10min） 2. 枪头及EP管的处理 
1) 0.1%DEPC水浸泡1~2w； 
2) 用镊子夹起枪头一一装入枪头盒中，用镊子夹起EP管放入饭盒中； 3) 高压灭菌50min，45度烘箱烘干。 
 
二. RNA的提取 
Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。 
在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。  
  1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10×106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞； 
  2、将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30℃下放置5分钟；然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。 在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟； 
  3、取上层水相（离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%）于一新的离心管，按每1mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温（15℃～30℃）放置10分钟，12000g（2℃～8℃）离心10分钟。 
4、弃去上清液（RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁），按每1ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇进行洗涤，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。 
5、小心弃去上清液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。 
6、加适量Rnase-free water 溶解RNA沉淀（60℃ 10min）。-70℃保存备用。 7、RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 
[注意]  
1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值 
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。 
 
在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA提取过程中注意避免mRNA 的断裂；取2ug进行RNA检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂。